胺基酸與蛋白質

TinyNotes

前言

以α胺基酸為主(氨基接在α碳上)，因為β胺基酸的自由度太大，不易組成穩定的結構
以L form的胺基酸存在，其D，L乃由glyceraldehyde為基準(relative configuration)，與其旋光性沒有直接的相關聯(D，L只是自然界的一種選擇)
20種胺基酸：(略)，以下列出幾點較特別的性質
- 能進行磷酸化的胺基酸：含OH：Ser Thr Tyr
- 具有兩個chiral center：Ile Thr
- 第21號胺基酸：Selenocysteine：cys的硫由Se取代
胺基酸的吸光
- 帶芳香族在280nm的紫外光處有強吸光，Trp > Tyr > Phe
- 可用來測定蛋白質的濃度(假定各蛋白質Trp，Tyr的比例差不多)
- 在側定peptide時，因不一定含有Trp或Tyr，故選擇220nm作側定
胺基酸的解離
- 胺基酸為zwitterion，在特定pH時可一端帶負電，一端正電
- 具有多個可解離之氫離子，當pH=pKa時，釋放出氫離子而改變電性
- 當達某特定pH，其帶電量為0，此時的pH稱為PI(等電點)
- 等電點的計算為『進入不帶電』的pKa與『離開不帶電』的pKa之平均
- 有些R group亦帶有可解離之氫離子，情況更為複雜(背順序!!!)

(1) 表示法

( 2) 分析的方法1：初步分離

(3) 分析的方法2：column管柱分析

gel filtration
利用分子大小進行分離。管柱多孔洞，分子較小者會trap於其中，在管柱的時間越長，可取得自然狀態的蛋白質
ion exchange
利用帶電量進行分離，管柱上有帶電的擔體
DEAE(anion exchanger)：帶正電，pH不能大於9
CM(cation exchanger)：帶負電，pH不能小於5
affinity法
利用蛋白質與ligand的專一性結合作分離，純化佳
hydrophobic法
利用疏水性相結合的特性
HPLC：有兩種方式
normal phase：管柱為親水性，mobile phase為有機溶劑
reverse phase：管柱為疏水性(wax)，mobile phase為親水性

(4) 分析的方法3：電泳electrophoresis (分離，定分子量)

可參考網站http://juang.bst.ntu.edu.tw/ECX/Ana3.htm
用途：分離，定性分析(電泳會造成變性)
電泳膠體：acrylamide，濃度越高，孔徑越小(見實驗講義)
公式：μ=V(速率)/E(電場)=Z(帶電量)/f(泳動阻率)
泳動阻率受到形狀，大小影響
SDS page
SDS為一介面活性劑，會插入胺基酸長鏈中，除去電荷的效應；同時也破壞蛋白質的二，三級結構成為直鏈(不包括雙硫鍵)
結論是：分子量越大，跑越慢
IEF
等電點電泳：使蛋白質依照pI的不同而分離
利用pH梯度進行電泳，當pH=PI時不帶電，停止泳動
二維電泳
先進行IEF後，在進行SDS，順序不可顛倒!!!!!!
與Mass為蛋白質體學的基礎!!!!!!

(5) 分析的方法4：Mass (定蛋白質序列)

原本傳統的Mass不適合蛋白質分析(高溫氣化)，直到MALDI TOF與ESI兩種方式的誕生，才解決這個問題
MALDI TOF
經過trypsin切割後的peptide置放於一matrix，可吸收peptide氣化後多餘的能量，避免蛋白質被分解。接著計算其飛行的時間(Time Of Fly)，判斷質量。
ESI：electrospray ionization
將peptide包附於液滴，後進入Mass作分析
可藉由各碎片的質量，推算出peptide的序列，後再由基因庫得之完整序列→得到蛋白質

(6) 分析的方法5：免疫染色法ELISA與Western Blot (蛋白質定量與有無)

ELISA與Western Blot皆利用抗體辨認特定蛋白質，在使用『辨識抗體的抗體』(secondary antibody)接上先前的抗體。若secondary antibody為呈色劑，可藉由顏色的有無或深淺來判斷蛋白質的有無與量的多寡。
Western Blot為將電泳膠體上的蛋白質吸附到nitrocellulose上，以方便進行上述的抗體染色過程(膠體太軟了)
ELISA：將樣本覆蓋於杯底，並使用抗體染色法來定性定量

(7) 分析的方法6：protein的定量

(1) 決定分子量：

(2) 決定胺基酸的序列

(3) 雙硫鍵位置的確認

加入trypsin作切割，並利用還原法破壞雙硫鍵後，利用Edman法定出蛋白質序列，將這些片段作蛋白質電泳，得到一張圖
接著將這段peptide用trypsin切割，不破壞雙硫鍵後進行電泳，比對即可知道，消失的片段由雙硫鍵聯接
破壞雙硫鍵的方法有二
- 氧化法：加入performic acid
- 還原法：加入β-mercaptoethanol或是DTT還原成SH；並加入iodoacetate乙醯化後保護之

(4) 酵素的切割