胺基酸與蛋白質
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前言
- system biology:以系統化的方式進行研究,使用bioinformatics的方式,整合各領域的研究
- translational medicine:轉譯醫學,連結基礎研究至臨床應用
胺基酸
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以α胺基酸為主(氨基接在α碳上),因為β胺基酸的自由度太大,不易組成穩定的結構
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以L form的胺基酸存在,其D,L乃由glyceraldehyde為基準(relative configuration),與其旋光性沒有直接的相關聯(D,L只是自然界的一種選擇)
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20種胺基酸:(略),以下列出幾點較特別的性質
- 能進行磷酸化的胺基酸:含OH:Ser Thr Tyr
- 具有兩個chiral center:Ile Thr
- 第21號胺基酸:Selenocysteine:cys的硫由Se取代
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胺基酸的吸光
- 帶芳香族在280nm的紫外光處有強吸光,Trp > Tyr > Phe
- 可用來測定蛋白質的濃度(假定各蛋白質Trp,Tyr的比例差不多)
- 在側定peptide時,因不一定含有Trp或Tyr,故選擇220nm作側定
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胺基酸的解離
- 胺基酸為zwitterion,在特定pH時可一端帶負電,一端正電
- 具有多個可解離之氫離子,當pH=pKa時,釋放出氫離子而改變電性
- 當達某特定pH,其帶電量為0,此時的pH稱為PI(等電點)
- 等電點的計算為『進入不帶電』的pKa與『離開不帶電』的pKa之平均
- 有些R group亦帶有可解離之氫離子,情況更為複雜(背順序!!!)
蛋白質分析
(1) 表示法
- 左端為N端,右端為C端
( 2) 分析的方法1:初步分離
- 利用硫氨鹽析法(ammonium sulfate),將蛋白質鹽析沉澱(salting out)
- 改變鹽濃度與離心,取得想要的protein
- 利用dialysis法,去除吸附在蛋白質上的salt,以利後續的分析
(3) 分析的方法2:column管柱分析
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gel filtration
利用分子大小進行分離。管柱多孔洞,分子較小者會trap於其中,在管柱的時間越長,可取得自然狀態的蛋白質 -
ion exchange
利用帶電量進行分離,管柱上有帶電的擔體
DEAE(anion exchanger):帶正電,pH不能大於9
CM(cation exchanger):帶負電,pH不能小於5 -
affinity法
利用蛋白質與ligand的專一性結合作分離,純化佳 -
hydrophobic法
利用疏水性相結合的特性 -
HPLC:有兩種方式
normal phase:管柱為親水性,mobile phase為有機溶劑
reverse phase:管柱為疏水性(wax),mobile phase為親水性
(4) 分析的方法3:電泳electrophoresis (分離,定分子量)
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可參考網站http://juang.bst.ntu.edu.tw/ECX/Ana3.htm
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用途:分離,定性分析(電泳會造成變性)
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電泳膠體:acrylamide,濃度越高,孔徑越小(見實驗講義)
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公式:μ=V(速率)/E(電場)=Z(帶電量)/f(泳動阻率)
泳動阻率受到形狀,大小影響 -
SDS page
SDS為一介面活性劑,會插入胺基酸長鏈中,除去電荷的效應;同時也破壞蛋白質的二,三級結構成為直鏈(不包括雙硫鍵)
結論是:分子量越大,跑越慢 -
IEF
等電點電泳:使蛋白質依照pI的不同而分離
利用pH梯度進行電泳,當pH=PI時不帶電,停止泳動 -
二維電泳
先進行IEF後,在進行SDS,順序不可顛倒!!!!!!
與Mass為蛋白質體學的基礎!!!!!!
(5) 分析的方法4:Mass (定蛋白質序列)
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原本傳統的Mass不適合蛋白質分析(高溫氣化),直到MALDI TOF與ESI兩種方式的誕生,才解決這個問題
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MALDI TOF
經過trypsin切割後的peptide置放於一matrix,可吸收peptide氣化後多餘的能量,避免蛋白質被分解。接著計算其飛行的時間(Time Of Fly),判斷質量。 -
ESI:electrospray ionization
將peptide包附於液滴,後進入Mass作分析
可藉由各碎片的質量,推算出peptide的序列,後再由基因庫得之完整序列→得到蛋白質
(6) 分析的方法5:免疫染色法ELISA與Western Blot (蛋白質定量與有無)
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ELISA與Western Blot皆利用抗體辨認特定蛋白質,在使用『辨識抗體的抗體』(secondary antibody)接上先前的抗體。若secondary antibody為呈色劑,可藉由顏色的有無或深淺來判斷蛋白質的有無與量的多寡。
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Western Blot為將電泳膠體上的蛋白質吸附到nitrocellulose上,以方便進行上述的抗體染色過程(膠體太軟了)
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ELISA:將樣本覆蓋於杯底,並使用抗體染色法來定性定量
(7) 分析的方法6:protein的定量
- 由光譜分析法:280nm
- Lowry method
銅離子,Folin試劑會與蛋白質的peptide bond作用,產生藍色,藉由分度吸光器來判斷protein的量 - Ninhydrin法:與N端作用,形成藍紫色複合物
蛋白質的一級結構決定
(1) 決定分子量:
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SDS-PAGE:蛋白質denature後測得,subunit分離
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Gel filtration:藉由在管柱的時間推斷分子量,為nature狀態
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Ultracentrifugation:利用蛋白質的沉降速度,推出蛋白質的分子量
(2) 決定胺基酸的序列
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Sanger法
加入FDNB(fluorodinitrobenzene)僅辨識N端的第一個胺基酸 -
Edman法
加入PTH,與N端作用,可一個一個將胺基酸拆下來,分析得到胺基酸整個序列 -
現在多利用定序幾段peptide,回推到genome的資料庫,直接調出該蛋白質的序列
(3) 雙硫鍵位置的確認
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加入trypsin作切割,並利用還原法破壞雙硫鍵後,利用Edman法定出蛋白質序列,將這些片段作蛋白質電泳,得到一張圖
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接著將這段peptide用trypsin切割,不破壞雙硫鍵後進行電泳,比對即可知道,消失的片段由雙硫鍵聯接
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破壞雙硫鍵的方法有二
- 氧化法:加入performic acid
- 還原法:加入β-mercaptoethanol或是DTT還原成SH;並加入iodoacetate乙醯化後保護之
(4) 酵素的切割
- Trypsin:切K(lys)與R(Arg)的C端
- Cyanogen bromide:切Met的C端
胺基酸的化學合成
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Fmoc的作用:保護amino acid的N端,經由有機鹼可沖去
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DCC的作用:活化amino acid的C端,使之與N端作用
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步驟如下
(a) 先將用Fmoc保護的amino acidC端接在樹脂上
(b) 加入有機鹼去掉Fmoc的保護
(c) 準備另一管Fmoc保護的amino acid,加入DCC活化C端
(d) 將這管的amino acid加入,生成peptide bond
(e) 利用同樣的原理,可以一直接下去。最後再用HF切掉樹脂
(f) 為求效率,現在通常設計兩個胺基酸接在一起的樹脂
蛋白質體學:proteomic
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現代蛋白質體學的發展主要導因於:二維電泳與Mass技術的發展
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定義:某一組織或細胞在一定條件時間下所表現的所有蛋白質,其相關言就稱proteomics
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應用
- 大規模鑑定蛋白質
- 分析不同狀態的細胞呈現之蛋白質差異(ex. Tumor cell)
- 開發藥物,研究未知蛋白的功能
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基因不能申請專利;但研究出某基因的功能可申請專利