胺基酸與蛋白質


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    前言

    • system biology:以系統化的方式進行研究,使用bioinformatics的方式,整合各領域的研究
    • translational medicine:轉譯醫學,連結基礎研究至臨床應用

    胺基酸

    • 以α胺基酸為主(氨基接在α碳上),因為β胺基酸的自由度太大,不易組成穩定的結構

    • 以L form的胺基酸存在,其D,L乃由glyceraldehyde為基準(relative configuration),與其旋光性沒有直接的相關聯(D,L只是自然界的一種選擇)

    • 20種胺基酸:(略),以下列出幾點較特別的性質

      • 能進行磷酸化的胺基酸:含OH:Ser Thr Tyr
      • 具有兩個chiral center:Ile Thr
      • 第21號胺基酸:Selenocysteine:cys的硫由Se取代
    • 胺基酸的吸光

      • 帶芳香族在280nm的紫外光處有強吸光,Trp > Tyr > Phe
      • 可用來測定蛋白質的濃度(假定各蛋白質Trp,Tyr的比例差不多)
      • 在側定peptide時,因不一定含有Trp或Tyr,故選擇220nm作側定
    • 胺基酸的解離

      • 胺基酸為zwitterion,在特定pH時可一端帶負電,一端正電
      • 具有多個可解離之氫離子,當pH=pKa時,釋放出氫離子而改變電性
      • 當達某特定pH,其帶電量為0,此時的pH稱為PI(等電點)
      • 等電點的計算為『進入不帶電』的pKa與『離開不帶電』的pKa之平均
      • 有些R group亦帶有可解離之氫離子,情況更為複雜(背順序!!!)

    蛋白質分析

    (1) 表示法

    • 左端為N端,右端為C端

    ( 2) 分析的方法1:初步分離

    • 利用硫氨鹽析法(ammonium sulfate),將蛋白質鹽析沉澱(salting out)
    • 改變鹽濃度與離心,取得想要的protein
    • 利用dialysis法,去除吸附在蛋白質上的salt,以利後續的分析

    (3) 分析的方法2:column管柱分析

    • gel filtration
      利用分子大小進行分離。管柱多孔洞,分子較小者會trap於其中,在管柱的時間越長,可取得自然狀態的蛋白質

    • ion exchange
      利用帶電量進行分離,管柱上有帶電的擔體
      DEAE(anion exchanger):帶正電,pH不能大於9
      CM(cation exchanger):帶負電,pH不能小於5

    • affinity法
      利用蛋白質與ligand的專一性結合作分離,純化佳

    • hydrophobic法
      利用疏水性相結合的特性

    • HPLC:有兩種方式
      normal phase:管柱為親水性,mobile phase為有機溶劑
      reverse phase:管柱為疏水性(wax),mobile phase為親水性

    (4) 分析的方法3:電泳electrophoresis (分離,定分子量)

    • 可參考網站http://juang.bst.ntu.edu.tw/ECX/Ana3.htm

    • 用途:分離,定性分析(電泳會造成變性)

    • 電泳膠體:acrylamide,濃度越高,孔徑越小(見實驗講義)

    • 公式:μ=V(速率)/E(電場)=Z(帶電量)/f(泳動阻率)
      泳動阻率受到形狀,大小影響

    • SDS page
      SDS為一介面活性劑,會插入胺基酸長鏈中,除去電荷的效應;同時也破壞蛋白質的二,三級結構成為直鏈(不包括雙硫鍵)
      結論是:分子量越大,跑越慢

    • IEF
      等電點電泳:使蛋白質依照pI的不同而分離
      利用pH梯度進行電泳,當pH=PI時不帶電,停止泳動

    • 二維電泳
      先進行IEF後,在進行SDS,順序不可顛倒!!!!!!
      與Mass為蛋白質體學的基礎!!!!!!

    (5) 分析的方法4:Mass (定蛋白質序列)

    • 原本傳統的Mass不適合蛋白質分析(高溫氣化),直到MALDI TOF與ESI兩種方式的誕生,才解決這個問題

    • MALDI TOF
      經過trypsin切割後的peptide置放於一matrix,可吸收peptide氣化後多餘的能量,避免蛋白質被分解。接著計算其飛行的時間(Time Of Fly),判斷質量。

    • ESI:electrospray ionization
      將peptide包附於液滴,後進入Mass作分析
      可藉由各碎片的質量,推算出peptide的序列,後再由基因庫得之完整序列→得到蛋白質

    (6) 分析的方法5:免疫染色法ELISA與Western Blot (蛋白質定量與有無)

    • ELISA與Western Blot皆利用抗體辨認特定蛋白質,在使用『辨識抗體的抗體』(secondary antibody)接上先前的抗體。若secondary antibody為呈色劑,可藉由顏色的有無或深淺來判斷蛋白質的有無與量的多寡。

    • Western Blot為將電泳膠體上的蛋白質吸附到nitrocellulose上,以方便進行上述的抗體染色過程(膠體太軟了)

    • ELISA:將樣本覆蓋於杯底,並使用抗體染色法來定性定量

    (7) 分析的方法6:protein的定量

    • 由光譜分析法:280nm
    • Lowry method
      銅離子,Folin試劑會與蛋白質的peptide bond作用,產生藍色,藉由分度吸光器來判斷protein的量
    • Ninhydrin法:與N端作用,形成藍紫色複合物

    蛋白質的一級結構決定

    (1) 決定分子量:

    • SDS-PAGE:蛋白質denature後測得,subunit分離

    • Gel filtration:藉由在管柱的時間推斷分子量,為nature狀態

    • Ultracentrifugation:利用蛋白質的沉降速度,推出蛋白質的分子量

    (2) 決定胺基酸的序列

    • Sanger法
      加入FDNB(fluorodinitrobenzene)僅辨識N端的第一個胺基酸

    • Edman法
      加入PTH,與N端作用,可一個一個將胺基酸拆下來,分析得到胺基酸整個序列

    • 現在多利用定序幾段peptide,回推到genome的資料庫,直接調出該蛋白質的序列

    (3) 雙硫鍵位置的確認

    • 加入trypsin作切割,並利用還原法破壞雙硫鍵後,利用Edman法定出蛋白質序列,將這些片段作蛋白質電泳,得到一張圖

    • 接著將這段peptide用trypsin切割,不破壞雙硫鍵後進行電泳,比對即可知道,消失的片段由雙硫鍵聯接

    • 破壞雙硫鍵的方法有二

      • 氧化法:加入performic acid
      • 還原法:加入β-mercaptoethanol或是DTT還原成SH;並加入iodoacetate乙醯化後保護之

    (4) 酵素的切割

    • Trypsin:切K(lys)與R(Arg)的C端
    • Cyanogen bromide:切Met的C端

    胺基酸的化學合成

    • Fmoc的作用:保護amino acid的N端,經由有機鹼可沖去

    • DCC的作用:活化amino acid的C端,使之與N端作用

    • 步驟如下
      (a) 先將用Fmoc保護的amino acidC端接在樹脂上
      (b) 加入有機鹼去掉Fmoc的保護
      (c) 準備另一管Fmoc保護的amino acid,加入DCC活化C端
      (d) 將這管的amino acid加入,生成peptide bond
      (e) 利用同樣的原理,可以一直接下去。最後再用HF切掉樹脂
      (f) 為求效率,現在通常設計兩個胺基酸接在一起的樹脂

    蛋白質體學:proteomic

    • 現代蛋白質體學的發展主要導因於:二維電泳與Mass技術的發展

    • 定義:某一組織或細胞在一定條件時間下所表現的所有蛋白質,其相關言就稱proteomics

    • 應用

      • 大規模鑑定蛋白質
      • 分析不同狀態的細胞呈現之蛋白質差異(ex. Tumor cell)
      • 開發藥物,研究未知蛋白的功能
    • 基因不能申請專利;但研究出某基因的功能可申請專利



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