組織學相關技術


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    基本步驟

    (1) fixation

    • 利用共價鍵的生成,讓物質的相對位置固定
    • LM:fomalin的醛基能與一級胺作用
    • EM:osmium tetraxide:能與雙鍵CC產生cross link

    (2) dehydration

    • 利用alcohol

    (3) embedding

    • 利用parrafin(石蠟)或是plastic resin(樹脂)包埋

    (4) sectioning

    • 利用microtome做切割

    (5) mounting

    • 光學用載玻片,電顯用copper grid

    (6) staining

    • 光學用染劑法;電顯用鉛、鈾等原子序大的金屬,因放出的電子較多能夠增加對比度

    染色

    (1) dye染劑染色法

    • hematoxylin與eosin:H E染色法
      • hematoxylin帶正電,染負電物質(ex.核酸),藍色
      • eosin帶負電,染正電物質(ex. 蛋白質中的Arg , Lys)
    • acidic dye:帶負電荷,染basic substance
      Basic dye:帶正電荷,染acidic substance

    (2) enzyme histochemistry

    • 利用酵素作用mechanism,給予適當的substance以偵測該酵素的位置

    (3) immunocytochemistry

    • 設計抗體辨識特定的物質,在利用螢光呈色,標示該物質的位置
    • 依照螢光物質接的位置分成direct與indirect兩種
      • direct:primary antibody上有螢光物質,直接辨識target
      • indirect:primary antibody辨識target,再加入帶有螢光物質的’secondary antibody辨識primary antibody

    (4) FISH(fluorescent in situ hybridization)

    • 加入一段帶有螢光的DNA probe(探針),會與其互補的DNA,mRNA片段hybridize
    • 藉此可以偵測特定gene,mRNA的位置(ex,唐氏症的檢測)

    (5) autoradiograph

    • 利用放射性標定,觀察生化路徑或是標定酵素位置
    • 加入標定的amino acid,即可觀察細胞中合成蛋白質的路徑

    顯微鏡介紹

    (1) 光學顯微鏡(LM):就是光學顯微鏡!

    (2) 螢光顯微鏡

    (3) 共軛焦顯微鏡:能夠聚焦在特定的layer,以得到較好的畫面

    (4) 原子力顯微鏡:atomic force

    • 利用雷射與tip,可以偵測物體的surface情況

    (5) 電子顯微鏡:分成TEM(穿透式),SEM(掃描式)

    • 利用電子束取代光源
    • 因為使用電子束,所以要抽真空避免干擾,故無法觀察活體細胞

    細胞胞器的分離

    • 將細胞打碎後,使用離心機(centrifuge),依照其沉降係數做分離
    • 要注意離心的時間,太長會全沉降,太短解析度差
    • 可以使用sucrose溶液的gradient,胞器將會沉至其相近s值的layer
    • 離心機的單位以g值較好,轉速所造成的效果不同機器有差異