組織學相關技術

[TinyNotes]

基本步驟

(1) fixation

• 利用共價鍵的生成，讓物質的相對位置固定
• LM：fomalin的醛基能與一級胺作用
• EM：osmium tetraxide：能與雙鍵CC產生cross link

(2) dehydration

• 利用alcohol

(3) embedding

• 利用parrafin(石蠟)或是plastic resin(樹脂)包埋

(4) sectioning

• 利用microtome做切割

(5) mounting

• 光學用載玻片，電顯用copper grid

(6) staining

• 光學用染劑法；電顯用鉛、鈾等原子序大的金屬，因放出的電子較多能夠增加對比度

染色

(1) dye染劑染色法

• hematoxylin與eosin：H E染色法

  • hematoxylin帶正電，染負電物質(ex.核酸)，藍色
    * eosin帶負電，染正電物質(ex. 蛋白質中的Arg , Lys)

• acidic dye：帶負電荷，染basic substance
  Basic dye：帶正電荷，染acidic substance

(2) enzyme histochemistry

• 利用酵素作用mechanism，給予適當的substance以偵測該酵素的位置

(3) immunocytochemistry

• 設計抗體辨識特定的物質，在利用螢光呈色，標示該物質的位置
• 依照螢光物質接的位置分成direct與indirect兩種
  • direct：primary antibody上有螢光物質，直接辨識target
  • indirect：primary antibody辨識target，再加入帶有螢光物質的’secondary antibody辨識primary antibody

(4) FISH(fluorescent in situ hybridization)

• 加入一段帶有螢光的DNA probe(探針)，會與其互補的DNA，mRNA片段hybridize
• 藉此可以偵測特定gene，mRNA的位置(ex,唐氏症的檢測)

(5) autoradiograph

• 利用放射性標定，觀察生化路徑或是標定酵素位置
• 加入標定的amino acid，即可觀察細胞中合成蛋白質的路徑

顯微鏡介紹

(1) 光學顯微鏡(LM)：就是光學顯微鏡！

(2) 螢光顯微鏡

(3) 共軛焦顯微鏡：能夠聚焦在特定的layer，以得到較好的畫面

(4) 原子力顯微鏡：atomic force

• 利用雷射與tip，可以偵測物體的surface情況

(5) 電子顯微鏡：分成TEM(穿透式)，SEM(掃描式)

• 利用電子束取代光源
• 因為使用電子束，所以要抽真空避免干擾，故無法觀察活體細胞

細胞胞器的分離

• 將細胞打碎後，使用離心機(centrifuge)，依照其沉降係數做分離
• 要注意離心的時間，太長會全沉降，太短解析度差
• 可以使用sucrose溶液的gradient，胞器將會沉至其相近s值的layer
• 離心機的單位以g值較好，轉速所造成的效果不同機器有差異